Phương Pháp Xét Nghiệm PCR Trong Xét Nghiệm Vi Sinh Vật

Xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản ứng chuỗi polymerase, là một trong những bước ngoặt vĩ đại nhất của công nghệ sinh học. Đây là kỹ thuật giúp tạo ra hàng tỷ bản sao từ 1 đoạn DNA mẫu ban đầu giúp phát hiện chính xác sự có mặt hay không có mặt của tác nhân gây bệnh trong thời gian ngắn.

Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, khắc phục được hạn chế của phương pháp nuôi cấy vi sinh đối với những tác nhân gây bệnh khó nuôi cấy, phát triển chậm hoặc không thể nuôi cấy được theo phương pháp thông thường, lượng mẫu thấp và hạn chế trong các xét nghiệm miễn dịch đối với các tác nhân có các triệu chứng lâm sàng không điển hình hoặc chồng chéo ( Ví dụ: Vi rút viêm gan A, B,C,…). Cũng như các tác nhân gây bệnh nguy hiểm với con người như Ebola, SARS, Cúm A H5N1,…

Xét nghiệm PCR được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán vì độ chính xác gần như tuyệt đối, giúp phát hiện mầm bệnh ngay cả khi chúng đang ở nồng độ rất thấp trong cơ thể. Dưới đây là các phương pháp xét nghiệm PCR phổ biến đang được sử dụng nhất hiện nay tại các bệnh viện và phòng lab y khoa và ứng dụng của chúng.

1. Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật đầu tiên được phát triển bởi Kary Mullis đạt giải Nobel hoá học năm 1983. Và công bố vào năm 1985

• Nguyên lý: Sử dụng chu kỳ nhiệt (biến tính, bắt cặp, kéo dài) để nhân bản luỹ thừa gen đích (2ⁿ copies).

• Mục đích: Khuếch đại in vitro từ 1 đoạn ADN ban đầu thành hàng tỷ bản sao.

• Cách đọc kết quả: Sau khi kết thúc quá trình chạy máy, mẫu được mang đi điện di trên gel agarose. Các vạch DNA sẽ hiện lên dưới ánh sáng tia cực tím, giúp xác định có sự hiện diện của gen mục tiêu hay không dựa vào kích thước.

• Ứng dụng sớm: Chẩn đoán Lao, viêm gan B

• Ngày nay, phương pháp PCR cổ điển đã được phát triển thành nhiều kỹ thuật PCR mới hiện đại, ưu thế hơn.

2. RT-PCR (Reverse Transcription – PCR)

Kỹ thuật RT – PCR (phiên mã ngược)

• Nguyên lý: khuếch đại in vitro tạo bản sao từ 1 đoạn RNA mẫu. Do máy PCR chỉ khuếch đại được DNA, nên kỹ thuật này cần thêm một bước đệm là dùng enzyme phiên mã ngược để chuyển RNA thành cDNA trước khi khuếch đại.

• Ứng dụng: Dùng để xác định sự có mặt của các loại virus có vật chất di truyền là RNA (như HIV, HCV, SARS-CoV-2, Cúm, Sốt xuất huyết,..).

3. Real-time PCR (PCR thời gian thực)

Đây là phương pháp PCR có ưu điểm vượt trội nhất, được sử dụng phổ biến trong các bệnh viện, phòng Lab hiện nay. Phương pháp duy nhất định lượng DNA ngay trong quá trình khuếch đại. 

Ưu điểm vượt trội:

• Định lượng: Điểm khác biệt cốt lõi là nó cho phép quan sát kết quả và định lượng DNA/RNA mục tiêu ngay trong quá trình phản ứng đang diễn ra (theo thời gian thực), thay vì phải đợi đến khi kết thúc phản ứng

• Tốc độ: Có kết quả ngay khi máy đang chạy, không cần qua bước điện di. Phân tích kết quả bằng phần mềm, hiển thị trực tiếp trên màn hình. Quy trình khép kín giảm thiểu tối đa rủi ro ngoại nhiễm.

• Ứng dụng: Xét nghiệm chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi hiệu quả điều trị bệnh.

4. Multiplex PCR (PCR đa mồi)

• Nguyên lý: Thay vì chỉ tìm một tác nhân, Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một ống nghiệm để tìm kiếm đồng thời nhiều mục tiêu. Giúp phát hiện nhiều tác nhân hoặc nhiều đặc tính trong cùng 1 lần chạy, tiết kiệm thời gian và mẫu bệnh phẩm.

• Ứng dụng:  Xác định genotype ( kiểu gen) của virut và vi khuẩn.  Ví dụ: viêm gan B ( HBV) HBV A, HBV B, HBV C, HBV D